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用于有机磷农药残留检测酯酶的筛选

发布日期:2014-05-09 14:36:25  来源:本站整理  将本页收藏至:QQ书签 百度收藏

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用于有机磷农药残留检测酯酶的筛选

                                 用于有机磷农药残留检测酯酶的筛选
                       邓光辉1,张桂华1,孙果宋2,黄科林2,林润国2
    (1.广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006;2.广西化工研究院,广西南宁530004)
    摘要:利用农药对酯酶活力的抑制反应,测定了不同浓度的敌敌畏对游离的不同动物肝脏酯酶的酶活性。实验采用从动物肝脏中提取的粗酶液在水解后与显色剂固兰B盐作用,用分光光度计测定其在595nm处的吸光度。结果表明,猪肝中α-乙酸萘酯酶(α-NA Esterase)的活力较高,且对较低浓度的敌敌畏也有较好的灵敏度。鸡肝和鸭肝α-乙酸萘酯酶对敌敌畏浓度变化不是很明显。
    关键词:α-乙酸萘酯酶;有机磷农药;酶抑制法
    中图分类号:X174文献标志码:A doi:10.3969/j.issn.1003-6504.2010.12.04文章编号:1003-6504(2010)12-0014-02
    由于有机磷农药的高效及高残留,近年来出现了许多有关有机磷农药残留快速检测的报导,如何快速对空气、水和食品中的有机磷农药残留进行检测是个十分重要的问题。根据其物理化学及生物学特性,目前对其检测方法主要有色谱法、光谱法、酶抑制法及免疫学方法、化学发光技术、生物传感器等[1]。酶抑制法和生物传感器以其灵敏、简便、快速及选择性高而得到广泛应用。
    酶抑制法的生物识别原件主要有胆碱酯酶[2]、有机磷水解酶和植物酯酶三种[3]。
    本实验以农药敌敌畏对酯酶活力的抑制反应为指标,利用动物肝脏中的α-乙酸萘酯酶(α-NA Esterase),水解α-乙酸萘酯,产生α-萘酚,α-萘酚又可与显色剂固蓝B盐作用形成紫红色偶氮化合物[4],从而对鸡、鸭、猪肝的粗酶液中的α-乙酸萘酯酶活性进行了检测。   1·实验部分
    1.1仪器与试剂
    1.1.1仪器
    916型紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC公司);微量移液器Nichipet EX(0.5~10μL和10~100μL,Made in Japan);组织捣碎机(DS-1型,上海标本模型厂);离心机(90-1型,北京通用离心机厂)。
    1.1.2试剂
    鸡肝、鸭肝、猪肝:广西民族大学菜市场;敌敌畏:市售产品;α-乙酸萘酯(北京化工厂);固兰B(上海标本模型厂);Tri(s国药集团化学试剂有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA)(广东光华化学厂有限公司);十二烷基磺酸钠(SDS)(广东光华化学厂有限公司);2,6-二叔丁基对甲酚(国药集团化学试剂有限公司);甲苯磺酞氟(Beijing Biotechology Co.Ltd);柠檬酸钠(广州化学试剂厂);柠檬酸(天津市化学试剂一厂);其它试剂均为分析纯;水为实验自备二次蒸馏水。
    1.2方法
    1.2.1动物肝酯酶的制备
    将30.0g的动物肝脏与100mL 0.lmol/L Tris-乙酸缓冲溶液(pH7.4)混合,加入2,6-二叔丁基对甲酚和甲苯磺酞氟,使这两种试剂的最终浓度分别为45μmol/L和115μmo/L,磨碎,离心,上清液即肝脏酯酶,贮于-18℃冻藏备用。
    1.2.2总酯酶活力的测定
    总酯酶活力的测定方法参照文献[5-6],并做了适当改进。在试管中依次加入1.950mL缓冲溶液(0.04mol/L,pH 4.0~7.5)、50μLα-乙酸萘酯丙酮溶液(16mmol/L)和0.5mL稀释后的上清液,混匀后,放入30℃的恒温水浴中反应15min,取出试管,在其中加入0.5 ml固兰B盐溶液(0.8%,溶剂为3.4%SDS),振荡混匀,放入30℃的恒温水浴中水浴10min,取出试管,采用分光光度计,在595nm处测其溶液吸光度。根据α-萘酚标准曲线和测得的吸光度,可以得到总酯酶活力的计算式为[7]
             
    式中:E-每mL酶液所含的总酯酶活力,U/mL;N-酶液的稀释倍数;K-α-萘酚的标准曲线的斜率(mol(/L·A));A595-反应后在波长595nm处测得的吸光度。
    U为酶活力单位,1U定义为在规定条件下,每分钟催化得到1μmolα-萘酚所需的酶量。
    1.2.3敌敌畏的灵敏度测试[8-9]   用不同pH值的缓冲溶液将敌敌畏稀释为不同pH值下的浓度系列(10-3~10-7mol/L)。按总酯酶活力测试步骤,将1.950mL含有不同浓度农药的缓冲液取代不含农药的缓冲液,测试敌敌畏对动物酯酶的抑制程度,其计算式:
    抑制率(%)=(E1-E)2/E1×100%式中:E1-未受农药抑制时酶液的酯酶活性(U);E2-受农药抑制时酶液的酯酶活性(U)。
    2·结果与讨论
    2.1不同动物组织酶活力比较
    根据α-乙酸萘酯酶在不同生物中的分布规律,并依照酶含量丰富、廉价易得的指导原则,研究了三种不同动物组织总酯酶活力,结果见表1。
             
    从表1可知,在一定的稀释倍数范围内,鸡肝和鸭肝的酯酶的活力随着稀释倍数的增大而增大,但稀释倍数为200或200以上时,酶活检测不到。而当稀释倍数在300以下时,猪肝中酯酶的活力检测不到,而稀释倍数在300,甚至更高时酶活也能检测到,且数据较大,说明相对于鸡肝和鸭肝,猪肝中酯酶的活力较高。
    2.2α-乙酸萘酯酶对农药的灵敏度
    由于不同来源的酯酶对农药的敏感性不同,本实验以猪肝、鸡肝、和鸭肝作为实验材料,对常见农药敌敌畏进行敏感性研究,比较结果如图1。
              
    由图1可知,不同浓度敌敌畏对三种动物肝脏酯酶的抑制率不同,在浓度低于12mg/L时,鸡肝和鸭肝都随农药浓度的增大而降低,只有大于12mg/L时其对酯酶的抑制率明显增大,而对猪肝酯酶的抑制随着农药浓度的增大而增强,说明鸡肝和鸭肝中的酯酶对敌敌畏的灵敏度较低,猪肝中的酯酶对较低浓度的敌敌畏有较好的灵敏度。
    3·小结
    通过对不同动物肝脏的酯酶的比酶活力大小及对常见农药敏感性等因素的研究,结果表明,鸡肝、鸭肝和猪肝中酯酶都对农药敌敌畏有一定的灵敏度。猪肝中的α-乙酸萘酯酶不仅比活力高,而且对较低浓度的敌敌畏较敏感。因此,认为猪肝酯酶作为农药残留的检测用酶较好。
    [参考文献]略


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作者:佚名
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